1　试剂

1.1标准抗毒素

由中国药品生物制品检定所按期分发，所标单位应与国际单位等值。标准抗毒素应保存于2～8℃。

1.2毒素

由中国药品生物制品检定所分发。亦可自备，但应选经保存一年以上，毒力适宜的毒素。其制法（包括菌种、培养基、培养条件等）应与中国药品生物制品检定所分发者相同。试验用的毒素须以检定所分发的标准抗毒素准确标定其试验量（Lr/300），并每3个月复检1次。毒素应保存于2～8℃暗处，并加入甲苯或其他适宜防腐剂。

1.3稀释液

硼酸盐缓冲盐水，灭菌后pH值应为7.0～7.4。配方为：

氯化钠8.5g

硼酸4.5g

硼砂0.5g

加蒸馏水至1000ml，过滤。

2　用具

吸管、容量瓶、注射器应经标化（用双蒸馏水称量法或其他准确方法）。吸管、试管、容量瓶应洁净干燥，注射器及针头应煮沸消毒。

3　试验动物

用体重2～3kg的健康白皮肤家兔，试验前一日用适宜方法进行背部脱毛，凡皮肤有发炎或大量斑点现象者不应使用。

4　试验方法

4.1标准抗毒素之稀释

用稀释液稀释标准抗毒素，使每ml含IU/15（即20个IU/300），即与毒素等量混合后每0.1ml注射量中含IU/300。标准抗毒素原液的一次吸取量不应少于0.5ml。

4.2毒素之稀释

用稀释液稀释毒素，使每ml含20个试验量（Lr/300），即与抗毒素等量混合后每0.1ml注射量中含1个试验量（Lr/300）

4.3待检抗毒素之稀释

用稀释液将待检抗毒素稀释成数个稀释度，使每ml约含IU/15（即20个IU/300）或其上下，即与毒素等量混合后每0.1ml注射量中约含IU/300或其上下。稀释度之间隔约为5～10%。

4.4混合

定量吸取已稀释的标准抗毒素及不同稀释度之待检抗毒素分别装入小试管中，每管加入等量之稀释毒素，混合均匀，加塞，37℃结合1小时，立即注射。

混合时，吸取标准抗毒素，待检抗毒素及毒素的吸管不得混用（若不得不用同1支吸管混合待检抗毒素，则应由高稀释度向低稀释度依次吸取混合。每当更换1稀释度之前须将吸管内的剩余液吹净，将吸管外部所沾残液拭净，吸取下1稀释度液到前次吸取的最高处，废弃之，再于该管内连续吸吹3次。但1支吸管只得用于1份样品）。

4.5注射

每份样品注射2只家兔，每只家兔不能超过4份样品。每稀释度注射0.1ml于家兔皮内（应在近背脊两侧）。每只家兔至少应包括3个不同注射部位（前、中、后）的对照试验。

4.6观察

试验家兔于注射后48及72小时各观察1次，并测量反应面积。

4.7结果判定

4.7.1以48～72小时结果作最后判定。注射对照部位一般于48～72小时内轻度发红，其直径应为10～14mm。待检抗毒素之效价应以与多数对照的反应强度相同之最高稀释度判定之，但反应强度不得超过对照。

4.7.2有下列情况之一者应予重试：

（1）对照反应不合规定标准。

（2）待检抗毒素的稀释度过高或过低。

（3）反应不规则。