甲、钨酸沉淀法

1　试剂

1.110%钨酸钠溶液

取钨酸钠10g，加蒸馏水使溶解成100ml。

1.2　0.33mol/L硫酸溶液

量取化学纯硫酸1.86ml，缓缓注入适量的蒸馏水中，待冷加水稀释至100ml。

1.30.145mol/L氯化钠溶液

取氯化钠9g，加蒸馏水使溶解成1000ml。

2　操作

2.1　钨酸除蛋白质

精确量取样品2ml加蒸馏水14ml，加10%钨酸钠2ml，0.33mol/L硫酸2ml，摇匀，静置30分钟过滤。

2.2　精确量取样品1ml，用0.145mol/L氯化钠溶液准确稀释至每ml含氮量1mg左右。

2.3　精确量取稀释液1ml及除蛋白质滤液5ml，分别移入凯氏定氮瓶中，用半微量定氮法测定样品的总氮及非蛋白氮含量。

3　计算

样品总氮含量(mg/ml)=（样品滴定数-空白滴定数）×标准盐酸mol/L×14×稀释倍数

样品非蛋白氮含量(mg/ml)=（样品滴定数-空白滴定数）×标准盐酸mol/L×14×12

样品蛋白质含量(g/ml)=（总氮-非蛋白氮）×6.25×1/10

附注

1.样品蛋白质含量如超过10%(g/ml)，除蛋白质时应适当加大样品稀释倍数，10%钨酸钠及0.33mol/L硫酸用量相应地按比例增加，使溶液钨酸浓度仍保持1%。

2.总氮与非蛋白氮可用同一空白。

乙、三氯醋酸沉淀法

1　2%三氯醋酸溶液

取三氯醋酸12g，加蒸馏水溶解至100ml。

2　操作

精确量取一定体积的样品（含蛋白质6～12mg左右，于10ml尖底离心管中，加等体积的12%三氯醋酸混匀，放置半小时后3000r/min离心30分钟，倾净上清，沉淀用蒸馏水约3ml（分数次）洗入凯氏烧瓶，按半数量定氮法测定氮含量。

3　计算

（样品滴定数–　空白滴定数）×标准盐酸mol/L×14

样品蛋白质含量(mg/ml)──────────────────────×6.25

样品ml数

丙、微量法（Lowry法）

1.试剂

1.1　4%碳酸钠溶液

取4g碳酸钠，加蒸馏水溶解成100ml。

1.2　0.2mol/L氢氧化钠溶液

取0.8g氢氧化钠加蒸馏水，溶解成100ml。

1.3　0.04mol/L硫酸铜溶液

取1gCuSO4·5H2O加蒸馏水溶解成100ml。

1.42%酒石酸钾（或0.1mol/L酒石酸钠）

取2g酒石酸钾（或酒石酸钠），加蒸馏水溶解成100ml。

1.5　碱性铜液

临用前取试剂1.1和1.2各25ml，试剂1.3和1.3各0.5ml混匀配制而成。

1.6　酚试剂

称取100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O),25g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)，置1500ml烧瓶中，加入700ml蒸馏水，50ml　85%磷酸及100ml浓盐酸，上联回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸加流10小时，取下回流管，加入150g硫酸锂，50ml蒸馏水，几滴溴液，煮沸约15分钟，驱除过量的溴。冷却，加蒸馏水稀释至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。

酚试剂贮备液经标准氢氧化钠液滴定，测定酸浓度，而后用蒸馏水稀释至相当1mol/L盐酸浓度，即为酚试剂。

1.7　标准蛋白质溶液

取牛血清白蛋白标准品（由检定所统一标定发给），准确稀释至1mg/ml(含0.02%NaN3)，为标准蛋白质贮备液。精确量取标准蛋白质贮备液2.5ml于25ml容量瓶中，用含0.02%NaN3的蒸馏水稀释至刻度，为标准蛋白质溶液（100μg/ml）。

2　操作

2.1　样品

精确量取一定体积样品（含蛋白质50μg左右）于试管中，加5ml碱性铜液，混匀，于室温放置10分钟，快速加入0.5ml酚试剂，摇匀，于室温放置30分钟，用650nm波长或红色滤光片比色（呈色后，如发现混浊，经3000r/min离心15分钟后再比色）。

2.2　标准曲线

精确量取标准蛋白质溶液（100μg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置于试管中，加蒸馏水补至1ml，其余操作同样品，可得一标准曲线。

3　计算

从标准曲线查出样品相当标准蛋白质溶液之ml数A；

A×0.01%

样品蛋白质含量（g/ml）=　────────

样品ml数

附注

检测A群脑膜炎多糖抗原半成品原液可取1ml（含抗原3～10mg）。