1．Marsshall 氏法

（1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25～50ml）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。

（2）方法及步骤：

①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。

②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg 荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。

③结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。

④透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（2500r/min）20min，除去其中少量之沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0～4℃）过夜。

⑤过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定（图3-11，图-3-12）。

图3-11　 Sephadex G-25 对FITC

图3-12　FITC与家兔IgG球蛋白在25℃和2℃时结合的动力学（Kawamura 1964）

洗脱液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）;过滤量:12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析);收集量:20ml(稀释1.7倍)。

分别以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸盐缓冲液（分别为pH9.5和pH9.0），于2℃下搅拌将其各加入100mg家兔IgG生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分为两半。一半保留于2℃下，另一半置25℃下。间隔一定时间后各取出0.5ml通过sephadex G-25去游离FITC，由上计算出5mg家兔IgG结合的FITC量。

2．Chadwick 氏法

（1）材料：抗原球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶（25ml）、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）、透析袋、棉线、玻棒等。

（2）方法及步骤：

①抗体准备：用0～4℃pH8.0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。

②荧光色素准备：按每毫克蛋白加入荧光素0.01mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶解。

③将准备之抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在0～4℃，冰箱中结合18～24h。

④透析和柱层析：方法同Marshall 氏法。

3．改良法（1963年） 　根据Marshall 氏法取高价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0.15mol/l NaCl）及缓冲液（0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0） 稀释使每毫升内含蛋白10mg,缓冲液为总量的10%，降温至4℃，加入异硫氰酸盐荧光素，（蛋白：荧光素=50～80mg:1mg），在0～4℃下电磁搅拌12～14h。然后用半饱和和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用Nessler氏试剂测验至隔夜透析之盐水无氨离子及荧光色素为止）。将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%,分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，-20℃保存可达2年以上。

【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCl 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸馏水中，校定pH至7.2。

【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5mol/l Na2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/l NaHCO3(4.2%)90ml,混合后，校定pH至9.0。

【附三】3%重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水重碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。

4．透析标记法 此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。

（1）用0.025mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1%浓度，装入透析袋中。

（2）用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4℃电磁搅拌下，透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用sephadex G-50 凝胶过滤，去除游离荧光素，分装、贮存于4℃中（图3-13）。

图3-13　标记抗体溶液通过sephadex 产胶柱层析分布