一、免疫荧光或免疫酶标技术在肾脏疾病中的应用的意义

（一）肾小球疾病发病机制的研究

应用免疫荧光或免疫酶标技术，可对肾小球内免疫复合物沉积的机制、补体系统的激活途径、凝血机制的启动等进行研究，兹分述如下：

1．免疫复合物的形成及沉积的机制　有下列三种情况：

（1）抗原及抗体在血液循环中结合形成循环免疫复合物沉积于肾小球：常见于毛细血管内增生性肾小球肾炎，抗原（如链球菌、葡萄球菌等）侵入人体后，免疫系统产生相应抗体。抗原与抗体在血液循环中形成免疫复合物，经血液流至肾脏而沉积于肾小球内。荧光显微镜可见IgG沿肾小球毛细血管壁有弥漫性不连续的颗粒状荧光，一般其分布不太均匀，大小亦不太一致。

（2）肾小球抗原导致的原位免疫复合物形成：在感染或某些因素作用下，肾小球基底膜的结构成分了生改变而具有抗原性，可刺激机体免疫系统而产生抗基底膜抗体，可与肾小球基底膜结合而形成原位免疫复合物。在荧光显微镜下可见IgG沿肾小球毛细血管壁呈连续线状荧光。常见于Goodpasture 综合征。

（3）非肾小球抗原导致的原位免疫复合物形成：外源性抗原在一定条件下可先植入肾小球基底膜，抗原刺激免疫系统可产生相应抗体而出现于血液中，这种循环抗体当流经肾小球时与原先植入肾小球基底膜的抗原在原位结合而形成原位免疫复合物。在荧光显微镜下可见IgG沿肾小球毛细血管壁呈大小一致的、分布均匀的颗粒状荧光。常见于膜性肾小球肾炎。

2．补体系统激活的途径　补体系统一方面参与机体的正常防御功能，另一方面又可参与变态反应而引起组织损伤。补体的成分既可直接破坏靶细胞，又可产生炎症介质（如过敏毒素和趋化因子）而促发炎症反应，并可启动凝血机制，故在肾小球肾炎的发生发展过程中起着重要作用。补体的激活途径有二，即经典途径和旁路途径。

（1）经典途径：抗原与抗体结合形成免疫复合物后，抗体的Fc 段被激活，暴露其补体结合点，可与补体C1q结合，进一步使C1r、C1s活化， 再依次活化C4及C2，而使C3活化，继之C5、C6、C7、C8、C9相继活化。

（2）旁路途径：细菌内毒素或脂多糖可使血清中C3激活剂前体（C3PA）转化酶被激活，在备解素作用下，使C3PA（又称B因子）转化为C3A（C3激活剂），而使补体C3激活，然后依次激活C5至C9。

在多数肾小球疾病，补体之激活皆为通过旁路途径：仅少数肾小球疾病，如狼疮性肾炎、Wegener’s内芽肿等，其补体之激活为通过经典途径。因此，了解肾小球疾病时补体系统激活的途径有重要的鉴别诊断意义。例如在肾小球系膜区有多量IgA沉积时，同时有备解素B因子显示阳性，即其补体激活为旁路途径，此时则可诊断为IgA肾病。但如C1q、C4、C2显示阳性，即其补体激活为经典途径，则应诊断为狼疮性肾炎。

3．凝血机制的启动　在肾小球肾炎时，由于炎症造成肾小球毛细血管内皮细胞的损伤，毛细血管基底膜的暴露，以及补体C3b的免疫粘附作用使血小板聚集，而激活凝血因子Ⅲ、凝血因子ⅩⅠⅠ和血小板因子3，启动了凝血机制，结果使血浆中的纤维蛋白元转变为纤维蛋白（即纤维素）而于肾小球毛细血管内形成微血栓。如果炎症严重而发生渗出时，肾小球毛细血管内的纤维蛋白元也可渗出至球囊腔内，进一步转变为纤维素。球囊腔内的纤维素可刺激球囊壁层上皮细胞增生而形成新月体，使病变逐渐恶化。因此，对纤维蛋白相关抗原（FRA）的免疫荧光或酶标染色观察有重要的意义。

（二）判断肾脏疾病是否为免疫性疾病

在肾小球或肾小管如发现有免疫球蛋白或补体沉积时，一般皆为免疫性疾病，说明体液免疫参与其发病机制。其表现多种多样，已如前述。如未能发现有免疫球蛋白及补体沉积时，一般提示为非免疫性疾病，如Alport综合征、Fabry’s综合征及良性复发性血尿等。但慢性硬化性肾小球肾炎时，往往不能发现有免疫球蛋白或补体的沉积，有时偶可发现不规则而稀疏的免疫球蛋白散在性分布，这是由于硬化的肾小球病变陈旧，已无免疫反应参与。又如微小病变肾病，临床表现有严重的肾病综合征，但其肾穿刺标本荧光显微镜检查为阳性，无任何免疫球蛋白及补体沉积，这仅能说明体液免疫未参与其发病机制。现已证明本病为细胞免疫球蛋白及补体沉积，这仅能说明体液免疫未参与其发病机制。现已证明本病为细胞免疫异常所致，故仍为免疫性疾病。此外，在糖尿病性肾小球硬化时，常可见到肾小球内有IgG沿毛细血管壁呈连续线形沉积，这种现象目前认为是IgG的非特异性沉积，不能认为是免疫性疾病。

（三）有助于某些肾小球疾病的确诊

某些肾小球疾病，虽然其临床表现多种多样，但其肾穿刺组织检查有其免疫荧光或酶标染色的特征性表现，往往有助于肾小球疾病的确诊，甚至在光镜观察及电镜观察之前即可作出诊断。例如IgA肾病在临床上除表现为反复发作性血尿外，也可表现为蛋白尿、高血压、肾病综合征等。但如荧光显微镜发现肾小球系膜区有IgA沉积，并有备解素或B因子显示为旁路途径激活补体时，即可确诊为IgA肾病。如同时伴有皮肤紫癜、腹痛或关节　疼痛时，即可确诊为紫癜性肾炎。又如IgM肾病之诊断依赖于肾小球系膜区的IgM大量沉积；膜性肾小球肾炎之诊断则可根据沿肾小球毛细血管壁均匀一致的颗粒状荧光；局灶性节　段性肾小球硬化的诊断有赖于IgM在部分肾小球的节　段性沉积。又如肾小球内有多种免疫蛋白沉积，并伴随有C1q、C4或C2的沉积，显示补体系统为经典途径激活，即可确诊为狼疮性肾炎。因此，荧光显微镜的观察在诊断上占有很重要的地位。

（四）其他

目前对免疫球蛋白轻链和肾小球系膜内的细胞外基质，以及肾小管间质性疾病进行了研究，现介绍如下：

1．免疫球蛋白轻链在各型肾小球疾病中的分布　各种免疫球蛋白的重链，根据其结构及抗原性的不同，而可分为IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。轻链则仅有两种类型，即Kappa 及Lambda（κ轻链及λ轻链）。目前使用荧光素标记之羊抗人κ及λ单克隆抗体，对人类各型肾小球肾炎观察轻链分布之情况。初步观察结果为：系膜增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、局灶性硬化性肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、狼疮性肾炎时，κ与λ的轻链的沉积皆无明显差异，而IgA肾病时主要为λ轻链沉积，淀粉样变时则为大量κ轻链沉积。目前又有轻链性肾病的提法，常见于多发性骨髓瘤患者，可见有大量κ轻链沿肾小球底膜、肾小管基底膜、肾小球系膜区、小血管壁及间质中沉积，实际上仍为类似淀粉样之病变。

2．细胞外基质（ECM）的研究　肾小球中细胞外基质的变化与肾小球硬化的发生有十分密切的关系，目前已受到重视而成为研究的重点。ECM是种多种成分形成的高度有序列的网络结构，主要包括胶原、糖蛋白及蛋白多糖三类大分子物质。

（1）胶原：ⅠⅡⅢ型胶原呈纤维束状分布，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原呈纤维网状分布。

（2）糖蛋白：起将细胞粘着于细胞外基质的作用，主要包括纤维连接蛋白（fibronectin,FN）和层粘连蛋白（laminin, LN）。

（3）蛋白多糖：包括硫酸肝素、硫酸软骨素、透明质酸等。

从形态上，肾小球中ECM可分为系膜基质和肾小球基底膜两部分。近10余年来，ECM多种成份分离纯化的成功，相应抗体的制备，为利用免疫荧光或酶标技术对研究肾小球ECM的组成和分布提供了有利条件。目前研究结果表明，系膜基质及基底膜皆含有网状的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原，系膜基质中含纤维连接蛋白较多，而基底膜中含层粘连蛋白较多，且硫酸肝素含量丰富。肾脏间质中则主要为束状的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原。这些正常分布状况在肾小球疾病时可发生变化。目前已证实，在系膜增生性肾小球肾炎时，系膜基质中可出现Ⅰ型及Ⅲ型胶原，一般认为由系膜细胞所产生。此外，如前所述，很多生物活性因子可对系膜细胞起作用，使其增殖并合成及分泌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原、FN、LN及蛋白多糖，促进ECM的增多，逐渐使肾小球发生硬化。应用分子杂交免疫细胞化学技术，可对系膜细胞等探知相应分子的mRNA表达，从而更深入地研究肾小球硬化的发生机制。

3．肾小管间质性疾病　与免疫异常有关者有二种情况：

（1）肾小管间质中免疫复合物沉积：常见于狼疮性肾炎，可见IgG、IgM、IgA及C3呈颗粒状沉积于肾小管基底膜、肾小管周围毛细血管壁或散在于肾间质中。这种颗粒状沉积还可见于肾移植排斥反应。少数Sjogren 综合征的少数混合性冷球蛋白血症，也可见于特发性间质性肾炎。

（2）抗肾小管基底膜抗体性肾小管间质性疾病：在Goodpasture综合征时，除可见沿肾小球基底膜有IgG呈连续线形荧光外，同时也可看到肾皮质部的肾小管有IgG和C3呈连续线形沉积，最初常出现于近曲小管。这说明体内有抗肾小管基底膜抗体产生。此外，在一些药物性间质性肾炎、特发性间质性肾炎或肾移植急性排斥反应时也可见IgG及C3沿肾小管基底膜呈连续线形沉积。

二、免疫电镜技术在肾脏疾病中应用的意义

1．用以研究正常和病理状态下肾小球的超威结构成分及其变化　应用免疫酶标记的各种ECM成分的单克隆抗体，使用免疫电镜观察正常肾小球中各种结构成分如各型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、硫酸肝素等在基底膜和系膜区的分布状况，并对比观察在病理情况下出现的变化。这有助于深入了解肾脏疾病的时超威结构成分的分布和数量变化。

2．探讨肾脏疾病的病源　应用免疫电镜可清晰显示乙肝病理在肾小球及肾小管的分布部位及数量，以及确定其在细胞内之位置（胞浆内或胞核内）和与在上皮下或内皮下沉积之免疫复合物间的关系。目前并 可利用分子生物学技术鉴别乙肝病毒有无复制，从而深入探讨乙肝病毒相关性肾炎的发病机制。

3．研究肾小球内沉积之免疫复合物的组成成分及其形成过程　应用不同大小胶体金颗粒标记多种免疫球蛋白，以显示肾小球中沉积的电子致密物质（即免疫复合物）中各种免疫球蛋白的组成情况，以分析免疫复合物的组成成分。在动物实验中，可动态地观察肾小球肾炎时免疫复合物的形成过程。例如在动物的被动性Heymann肾炎时观察到特异抗体首先沉积于肾小球上皮细胞膜表面的有被小窝内，进一步聚集成帽，而后脱落至上皮下而成为上皮下沉积物的动态过程。这有助于对肾小球肾炎发病机制的深入研究。

4．有助于正确评价免疫荧光的观察结果　糖尿病性肾小球硬化病人的肾穿刺标本，免疫荧光观察显示IgG沿肾小球毛细血管壁呈连续线形荧光。目前有人应用免疫电镜技术未能证实有相应免疫球蛋白存在，这提示糖尿病时的免疫荧光阳性结果可能为肾小球基底膜通透性增加而导致的非特异性沉积所致。