一、分离基因进行结构分析

利用DNA离体转化，制备探针，制备基因文库进行筛检，最后鉴定载体中插入DNA片段的特性等一系列技术，可以设法分离出目的基因或某一特定的DNA顺序。然后通过DNA核苷酸顺序分析可以弄清楚某些疾病的病因。比如，人体癌基因的分离和研究癌基因同原癌基因在DNA的结构与功能上的差别，对了解细胞癌变的机制起了很大的作用。分离目的基因或专一DNA顺序更常用的是制备分子杂交探针，通过Southern印迹杂交或Northern印迹杂交等，了解某些遗传病患者基因结构上的差别，从而找到可靠的诊断方法。比如，患者的基因是否缺失，重排以及是否存在限制性片段长度的多肽现象等。

二、DNA限制性片段多态性连锁分析

DNA限制性片段长度多态性（restricitionfragment length polymorphism, RFLPs）连锁分析法是指由于缺失、重排或碱基置换的结果，使DNA分子中原有的某种限制性内切酶的识别位点发生改变，或是消失或是增加，所以酶切后生成的DNA片段的长度也随之改变。这种DNA限制性片段长度的变化往往同某种疾病的连锁关系，因而可作为这种疾病的诊断指标。

如果所分析的DNA分子不太大，比如人体线粒体DNA，长16569bp。在这种DNA分子上每种限制酶的识别点不过几个到几十个，因此，当某种限制酶的识别点发生改变并经过这种酶切后，可清楚地看到DNA电泳带的图型发生改变，条带或者增加或是减少，条带所处的位置也有变化。可是，遗传病病例分析时所用的是基因组DNA，而基因组DNA从限制酶酶切后至少会生成100万个片段，多的可达1000万个片段。如果其中有一、二个片段发生改变，不可能从电泳凝胶上直接观察分辨。此时就必定要用合适的探针。某个目的基因或某一特定的DNA片段，在同酶切后的DNA作分子杂交后，可在曝光的X线片上看到RFLP。图23-8是用分子杂交法检测RELP示意图。

图23-8　分子印迹杂交法则　RFLPs的示意图

这是通过限制酶A识别点的改变出现DNA的RFLP，再以合适的DNA片段作为分子杂交的探针，在探针上标记了放射性同位素，同分别经酶A，酶B完全酶切的DNA作印迹杂交。在曝光后的X线片上可看到不同的杂交带图型。①是正常个体，经酶A和酶B切后的DNA同探针杂交，都只看到一条带。②是一个杂合子即隐性突变基因携带者的杂交图式，由于它的一条染色体的DNA分子中酶A的识别点发生改变，酶切后的DNA片段较原来的长，所以出现一长一短两个片段。③是突变基因纯合子，也就是患者，酶A和B的酶切片段虽然是各有一个，但A的片段比正常的个体长，所以杂交带出现的位置也有改变。从图23-8可以看出研究RFLP的两个重要因素，一是要制备合适的探针，二是要用尽可能多的各种限制性内切酶进行酶切和杂交。

1974年首次用RFLP作为遗传学分析的方法。1978年简悦威和Dozy等第一次用人体β珠蛋白基因作为探针，同限制酶Hpa Ⅰ酶切的DNA做杂交，发现了DNA的RFLP与镰形细胞贫血之间的关系（表23-4）。

表23-4　DNA的RFLP与镰形细胞贫血的关系

Hb基因型	Hpa Ⅰβ珠蛋白基因片段（kb）					总计	13.0kb片段的频率
	7.6/7.6	7.6/7.0	7.0/13.0	7.6/13.0	13.0/13.0
黑人AA	8	6		2		15	0.03
AS	5	1	1	9		16	0.31
SS				4	11	15	0.87
白人AA	12					12
亚洲人AA	15					15

由此可以看出，HpaⅠβ珠蛋白基因13.0kb片段可作为检出镰形细胞贫血及携带者的一种指标。1981年Geever等根据镰形细胞贫血是β珠蛋白第6个密码子的一个核苷酸置换的结果，用限制酶DdeⅠ酶切DNA后与β珠蛋白基因杂交。结果是：Hb基因型AA的正常个体有175bp和201bp二条带。SS个体即患者只有一条带，是正常人两个DNA片段长度之和，即376bp。AS杂合子则有三条带：175bp、201bp、376bp。其原因是第6个密码子中的A被T置换，使Hb A变成了HbS。限制酶DdeI的识别顺序为C↓TNAG，当A变成T后，该部位DNA顺序变成CTNTG，从而丢失了一个DdeI识别位点，所以HbA的2个DdeI片段（175bp、201bp）变成了HbS的一个DdeI片段（175+201=376bp）。

除了用基因作探针直接检测基因内的核苷酸变化引起的RFLP外，还有两种途径：一是用基因作探针，检测该基因两侧顺序中核苷酸变化引起的RFLP，确定这些RFLP与遗传病之间有无连锁关系。另一种是用克隆的专一DNA顺序作探针，检测基因两侧顺序DNA的RFLP与遗传病的连锁关系。迄今用上述三种方法已查明近30种遗传病可通过RFLP来检测。表23-5、6、7为部位举例。

表23-5　用基因作探针检测基因内的结构变化来直接分析遗传病

遗传病	探针	年代
抗凝血酶Ⅲ缺乏症	抗凝血酶Ⅲ基因	1983
α1抗胰蛋白酶缺乏症	合成的寡核苷酸	1983
动脉粥样硬化症	载脂蛋白A-基因	1983
糖尿病	胰岛素基因	1983
Ehlers-Danlos综合症	α（1）胶原蛋白基因	1983
生长激素缺乏症	生长激素基因	1981
乙型血友病	凝血因子ⅠⅩ基因	1983
遗传性胎儿血红蛋白持存症	β珠蛋白基因	1979，1983
HPRT缺乏症	HPRT基因	1983
自毁容貌综合征	HPRT基因	1983
成骨不全	原α1（1）胶原蛋白基因	1983
视网膜母细胞瘤	Rb基因	1983
镰形细胞贫血	合成的寡核苷酸	1983
地中海贫血	β珠蛋白基因	1981
	α和β珠蛋白基因	1978，1980
甲型血友病	凝血因子Ⅷ基因	1985

表23-6　用克隆的DNA片段作探针检测连锁的RFIP间接分析遗传病

遗 传 病	探 针	探针与疾病基因座位间距离（cm）*	年 代
脆性X综合征	PN1，VK21，U6-2	＜5	1989
慢性进行性舞蹈病	G8	＜10	1983
Menkes钢发症	L1，28	16	1983
肌营养不良
良性假肥大型	XJ和per+87系列	?/FONT>	1983
假肥大型	XJ和per+87系列	?/FONT>	1986
强直性肌营养不良	补体C3基因	7	1983
类固醇-硫酸酯酶-X链锁甲癣	λRC8	25	1983
视网膜劈裂症（Retinoschisis）	λRC8	15	1983

表23-7　用基因作探针检测紧密连锁的RFLP间接分析遗传病

遗传病	基因探针	年代
糖尿病（Ⅱ型）	胰岛素基因	1981，1983
生长激素缺乏症（Ⅰ型）	生长激素基因	1982
高甘油三酯血症	载脂蛋白A-1基因	1983
苯酮尿症	苯丙氨酸羟化酶基因	1983

除了遗传病与RFLP之间的关系的资料，还发现人体癌基因Ha-ras的Bam HI片段的长度可在6.75～8.7kb之间变动。这种RFLP是由于Ha–ras基因有一段可变串联重复顺序（vari-able tandem replication,VTR）。重复顺序长28bp、重复次数可以不同，所以造成BamHⅠ片段的长度变化。图23-9中左图箭头是某种酶的切点，黑框代表可变串联重复顺序。右图代表某种酶切割后，不同个体显示的电泳图谱。1/1、2/2、3/3代表1、2、3等位基因的纯合子；1/2、1/2、2/3代表三种可能的杂合子，由于重复顺序数目不同改变了该酶的切点位置，因而形成不同长度的DNA片段。除Ha-ras癌基因外，成人多囊肾（adult polycystic kidney）基因旁也出现VTR，现已用它作携带者及产前诊断。

图23-9　可变串联重复顺序（VTR）示意图

三、聚合酶链反应

1988年Higuchi等报道，可以从人的单根毛发的毛囊细胞中抽提DNA，并结合运用DNA聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，分析了单根毛发细胞中抽提的线粒体DNA的D环区（D-loopregion）的“DNA”指纹图”。

PCR技术由Mullis等首创（详见第二十二章　）。它又称为DNA体外扩增技术，是用DNA聚合酶在体外扩增一段DNA顺序达百万倍以上。这样就可直接观察而不用印迹杂交法。这项技术的基本原理是，将有待扩增的DNA分子加热变性成为单链，然后加入按欲扩增DNA片段两端核苷酸顺序合成的一对引物和耐高温的DNA聚合酶，这样就可以单链DNA分子为模板合成了它的互补链。接着再加热使DNA双链解链。由于这类DNA聚合酶是耐高温的，所以在热变性处理后仍保持酶活性，在有引物分子存在的条件下又继续合成该DNA片段。如此循环往复20～30多个周期，微量的DNA分子可增加10万～100万个拷贝。

这种技术在医学上有很大的用途。先是Saiki等（1985）将其用于镰形表细胞性贫血的快速诊断。继而Chehab等将其用于Barts胎儿水肿综合征的前诊断（缺失纯合型）。我国吴冠芸、曾溢滔、蔡仕萍、张基增等在不同实验室将PCR结合寡核苷酸探针法用于已知点突变的β地中海贫血的产前诊断，并不断简化技术。目前PCR技术已用于许多疾病的诊断及产前诊断（如血友病、假肥大性肌营养不良、α₁抗胰蛋白酶缺乏症、艾滋病等）。原则上已知DNA顺序的基因及突变性质的遗传病都可以应用此技术。此外，PCR还可用于直接做DNA顺序分析。