一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序

（1）切片入PBS冲洗5min，最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。

（2）0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。

（3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。

（4）1μg/ml蛋白酶K，37℃保温30min。

（5）4%多聚甲醛PBS固定5min 。

（6）PBS冲洗2×3min。

（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。

（8）2×SSC冲洗10min。

（9）杂交：如是cDNA探针用前需进行变性处理，载片法时将切片在空气中晾干，加含探针的杂交液10μl于切片上，盖上22×22mm的硅化盖片或相当大小看蜡膜，³H标记探针每10μl杂交液含1×10⁵cpm探针，³²P或³⁵S标记探针每10μl杂交液含5×10⁵cpm探针；如是漂浮切片，则用灭菌吸水纸将切片水份尽量吸干，然后入杂交液，探针浓度和载片法一样。入杂交液后43℃保温12～16h。

（10）4×SSc 37℃冲洗10～30min。

（11）2×SSC（如为RNA探针则含20μg/ml RNase）37℃冲洗30min。

（12）1×SSC和0.1×SSc 37℃分别冲洗30min。

（13）PBS冲洗2×5min。（转录ISHH）

（14）0.5%H₂O₂PBS室温30min。

（15）1%BSA 37℃，30min 。

（16）第一抗体，4℃孵育16～24h。

（17）PBS冲洗4×5min。

（18）第二抗体37℃，1h。

（19）PBS冲洗3×5min。

（20）兔PAp 37℃，1h 。

（21）PBS冲洗3×5min。

（22）DAB显色液5～10min（DAB显色液：0.05%DAB + 0.03% H₂O₂PBS液配）。

（23）PBS冲洗3×5min。如是漂浮切片则将其贴于涂有粘附剂的载片上，晾干。

（24）切片入70%，85%，95%和2个100%酒精脱水，空气干燥。

（25）在暗室涂布乳胶（乳胶配制：乳胶原液：0.6mol/L醋酸胺=1：1），晾干，装入自显影暗盒。

（26）4℃曝光：³H标记探针4～8周，³⁵S标记探针1～4周，³²P标记探针7～10天。

（27）D₁₉₆显影液，20℃显影5～10min。

（28）自来水冲洗数秒。

（29）F₅坚膜定影液10min。

（30）自来水冲洗15min。

（31）切片温箱烤干，脱水，透明，封片。

结果：蛋白或多肽免疫反应阳性细胞为棕色胞质，而其相应mRNA为黑色银颗粒聚集。

二、非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法

非同位素标记物很多例如：生物素（biotin），地高辛（Digoxigenin），汞（mercury），溴（bromine）和碱性磷酸酶等，其中目前应用最多的是生物素和地高辛。将此法与免疫组化PAP法或ABC法联合使用，能成功地显示一些神经肽mRNA和神经肽的共存与共同分布。向正华等发现碱性磷酸酶抗地高辛抗体是经木瓜蛋白酶处理的，只有抗体的Fab段没有Fc段，而免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）所应用的抗体既有Fab段，又有Fc段。由于抗体的这一特性可在ISHH和ICC抗体孵育时将检测核酸的抗地高辛抗体Fab段与检测蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片，这样可明显缩短ISHH和ICC结合法的实验周期，同时还可以减少实验过程中对ICC检测的蛋白、多肽的损害，使结合法易成功。为什么两种抗体可同时混合孵育切片，这是因为抗地高辛抗体只有Fab段，而没有Fc段。我们知道抗体的抗原决定簇在Fc段，因此第二抗体与第一抗体的结合是第二抗体的Fab与第一抗体的Fc，所以第一抗体如果只有Fab段没有Fc段，那么第二抗体就无法与一抗结合。因此实验中将二种抗体混合孵育切片而不会产生交叉结合。以下为此法的原理图（图20-5）。

图20-5　原位杂交细胞化学与免疫细胞化学结合法

此种ISHH与ICC联合法稳定，实验周期短，蓝色与棕色反差强，是目前较好的ISHH与ICC结合法。详细程序如下：

（1）将切片漂浮于能经受高压灭菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2冲洗3×5min。

（2）0.1mol/L甘氨酸PBS冲洗5min。

（3）0.4% Triton X-100 PBS 15min。

（4）1μg./ml蛋白酶K（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配），37℃保温30min。

（5）4%多聚甲醛PBs 5min。

（6）PBS冲洗2×min。

（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配）10min。

（8）2×SSC冲洗10min。

（9）将切片用灭菌吸水纸吸干，然后入杂交液。核酸探针浓度为0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠脑冠状切片15μl杂交液足够。43℃保温12～16h。

（10）4×SSc 37℃冲洗30min。

（11）2×SSC（含RNasea 20μg/ml）37℃保温30min。

（12）1×SSC和0.5×SSc 37℃分别冲洗30min。

（13）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

（14）0.5%H₂O₂PBS室温20min。

（15）0.05mol/l PBS 冲洗2×5min。

（16）碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体（Fab）与抗蛋白或多肽等抗体混合液，前者一般1：1000稀释，后者则因抗体而异。稀释液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBSpH7.2，4℃孵育24h。

（17）0.05mol/l PBS冲洗4×5min。

（18）二抗（1：100～1：200）37℃保温1h。

（19）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

（20）PAP（1：200～1：400）37℃保温1h。

（21）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

（22）DAB显色液（0.05%DAB + 0.03% H₂O₂,0.05mol/L PBS pH7.2配）显色5～10min。

（23）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

（24）TSM，冲洗2×5min（TSM₁：0.1mol/l Tris – HCl pH8.0,0.1mol/LNaCl,0.01mol/L MgCl₂）.

（25）硝基四氮唑蓝（400μg/ml）和5-溴-4-3-吲哚磷酸（200μg/ml）混合液（TSM₂配显色混合液）显色1～3h，避光。

（26）20mmol/l EDTA终止显色。

（27）将切片贴于涂有铬矾明胶的载片上，空气干燥。

（28）梯度酒精脱水，透明、封片。

结果：ISHH阳性细胞的胞质呈紫蓝色，胞核不着色，示该细胞含XmRNA。ICC阳性细胞的胞质呈棕色，胞核不着色示该细胞含X多肽。双标记细胞的胞质为蓝棕混合色，示多肽与mR－NA共存于该细胞内。