核酸分子探针的制备首先需要获得所要的特异性核酸或其片段。可用以下方法制备：

（1）直接分离基因核酸：即从基因组上直接用内切酶切下所需基因。

（2）化学合成基因核酸：即以单核苷酸为原料，以固相磷酸三酯法合成某一结构完全清楚，分子量较小的寡核苷核。

（3）酶促合成核酸：在真核细胞中获得特异的结构基因。常用方法是以mRNA为模板，利用逆转录酶合成单链cDNA，再以大肠杆菌DNA聚合酶I合成双链的结构基因。

（4）RNA探针。